Identificazione e caratterizzazione biochimica di un nuovo N

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 16991 (2022) Citare questo articolo

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La N-acetilglucosamina (GlcNAc) è un componente chiave dei glicani come la glicoproteina e la parete cellulare. La GlcNAc chinasi è un enzima che trasferisce un fosfato su GlcNAc per generare GlcNAc-6-fosfato, che può essere un precursore per la sintesi dei glicani. Le chinasi GlcNAc sono state trovate in un'ampia gamma di organismi, inclusi lieviti patogeni, esseri umani e batteri. Tuttavia, questo enzima non è mai stato scoperto nel Saccharomyces cerevisiae, un modello eucariotico. In questo studio, la prima chinasi GlcNAc di S. cerevisiae è stata identificata e denominata Ngk1. I valori Km di Ngk1 per GlcNAc e glucosio erano rispettivamente 0,11 mM e 71 mM, suggerendo che Ngk1 possiede un'elevata affinità per GlcNAc, a differenza delle esochinasi. Ngk1 ha mostrato l'attività di fosforilazione del GlcNAc con vari trifosfati nucleosidici, vale a dire ATP, CTP, GTP, ITP e UTP, come donatori di fosforile. Ngk1 è filogeneticamente distante dagli enzimi conosciuti, poiché l'identità della sequenza aminoacidica con gli altri è solo del 20% circa o meno. Viene discusso anche il ruolo fisiologico di Ngk1 in S. cerevisiae.

La N-acetilglucosamina (GlcNAc), un carboidrato onnipresente sia nei procarioti che negli eucarioti, è un componente essenziale dei glicani come le N-glicoproteine, gli ancoraggi GPI e le pareti cellulari, compresi i peptidoglicani dei batteri e le chitine dei lieviti1,2,3. Per la biosintesi dei glicani, l'uridina difosfato N-acetilglucosamina (UDP-GlcNAc) è un substrato essenziale sia nei procarioti che negli eucarioti perché la porzione GlcNAc di questo zucchero nucleotidico è incorporata nei glicani dalle glicosiltransferasi2,3. Generalmente, l'UDP-GlcNAc è sintetizzato dal fruttosio-6-fosfato (Fru-6-P), un intermedio della glicolisi, che può essere convertito in glucosamina-6-P3. Negli eucarioti, la glucosamina-6-P viene acetilata in GlcNAc-6-P, seguita dall'isomerizzazione in GlcNAc-1-P3. Nei procarioti, d'altra parte, la glucosamina-6-P viene principalmente isomerizzata in glucosamina-1-P e quindi acetilata per essere GlcNAc-1-P3,4. Nella fase finale, GlcNAc-1-P viene convertito in UDP-GlcNAc mediante uridilazione sia nei procarioti che negli eucarioti3,4.

La GlcNAc chinasi (EC 2.7.1.59) è un enzima che metabolizza il GlcNAc scoperto in ampie specie di organismi, inclusi batteri, lieviti patogeni, piante e animali3,4,5,6,7,8. Questo enzima trasferisce il gruppo gamma-fosforile di un ATP sul gruppo ossidrile nel C-6 di GlcNAc per generare un GlcNAc-6-P. La GlcNAc chinasi è strutturalmente correlata all'esochinasi (EC 2.7.1.1), che è un altro tipo di zucchero chinasi che agisce preferenzialmente sul glucosio (Glc) per generare Glc-6-P nella prima fase della glicolisi, poiché questi enzimi hanno comunemente un'ATPasi dominio9,10. Nei mammiferi, la GlcNAc chinasi è nota come un enzima che fornisce una via di salvataggio della biosintesi di UDP-GlcNAc poiché questo enzima produce GlcNAc-6-P, che può essere un precursore di UDP-GlcNAc11. Al contrario, il ruolo di NagK, la chinasi GlcNAc di Escherichia coli, nell'utilizzo di GlcNAc per la biosintesi di Fru-6-P è stato studiato poiché esiste un percorso inverso per convertire GlcNAc-6-P in Fru-6-P per la fonte di energia nella glicolisi4. Allo stesso modo, anche CaNag5, la chinasi GlcNAc del lievito patogeno Candida albicans, è stata identificata e segnalata come coinvolta nell'utilizzo di GlcNAc per generare Fru-6-P come fonte di energia3,5,6. Come i batteri, C. albicans può crescere su GlcNAc come fonte di carbonio. In effetti, esiste un percorso per convertire GlcNAc in Fru-6-P in C. albicans, poiché il cluster genetico degli enzimi che metabolizzano il GlcNAc, costituito da GlcNAc chinasi (CaNAG5) e GlcNAc-6-P deacetilasi (CaNAG2) e glucosamina-6-P deaminasi (CaNAG1), è stata identificata dalla somiglianza della sequenza con questi enzimi di E. coli4. È stato dimostrato che l'alterazione di questi geni ritardava la crescita di C. albicans su GlcNAc come fonte di carbonio.

A differenza di C. albicans, il lievito in erba Saccharomyces cerevisiae non cresce su GlcNAc come fonte di carbonio3,5,6. Inoltre, qualsiasi gene simile a CaNAG5, CaNAG2 o CaNAG1 non è conservato nell'intero genoma di S. cerevisiae6. Pertanto, si è ritenuto che S. cerevisiae non possieda questi enzimi che metabolizzano il GlcNAc. In S. cerevisiae la presenza di tre esochinasi, Hxk1, Hxk2 e Glk1, è nota fin dagli anni '8012. Per diversi decenni si è creduto che S. cerevisiae non possedesse un'altra esochinasi diversa da Hxk1, Hxk2 e Glk1. Abbiamo però notato e focalizzato la presenza di altri due geni esochinasi-simili (ma le cui funzioni erano sconosciute): EMI2 e YLR446W. Nel nostro lavoro precedente, la proteina Emi2 è stata identificata come una quarta nuova esochinasi di S. cerevisiae oltre a quelle precedentemente note: Hxk1, Hxk2 e Glk113. In questo studio, ci siamo concentrati su un altro gene simile all'esochinasi, YLR446W (nome sistematico), che non ha un nome genetico standard, per esaminare se si tratta di una nuova esochinasi aggiuntiva in questo organismo modello. Inaspettatamente, abbiamo scoperto che YLR446W codifica una nuova chinasi GlcNAc che mostra una bassa somiglianza di sequenza con le chinasi GlcNAc note di altri organismi.