L'inibizione farmacologica dell'HDAC6 migliora i fenotipi muscolari nella distrofina

Nature Communications volume 13, numero articolo: 7108 (2022) Citare questo articolo

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L'assenza di distrofina nella distrofia muscolare di Duchenne distrugge il complesso glicoproteico associato alla distrofina con conseguente fragilità e atrofia delle fibre muscolari scheletriche, associate a fibrosi e disorganizzazione dei microtubuli e delle giunzioni neuromuscolari. Recentemente è stato dimostrato che la specifica istone citoplasmatica deacetilasi 6 (HDAC6) regola la distribuzione dei recettori dell'acetilcolina e l'atrofia muscolare. Qui, riportiamo che la somministrazione dell'inibitore selettivo HDAC6 tubastatina A nella distrofia muscolare di Duchenne, modello murino mdx aumenta la forza muscolare, migliora i microtubuli, la giunzione neuromuscolare e l'organizzazione del complesso glicoproteico associato alla distrofina e riduce l'atrofia muscolare e la fibrosi. È interessante notare che abbiamo scoperto che gli effetti benefici dell'inibizione dell'HDAC6 comportano la downregulation della segnalazione beta del fattore di crescita trasformante. Aumentando l'acetilazione di Smad3 nel citoplasma, l'inibizione di HDAC6 riduce la fosforilazione di Smad2/3, la traslocazione nucleare e l'attività trascrizionale. Questi risultati forniscono prove in vivo che Smad3 è un nuovo bersaglio di HDAC6 e implicano HDAC6 come potenziale bersaglio terapeutico nella distrofia muscolare di Duchenne.

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia neuromuscolare recessiva legata all'X che colpisce circa 1 neonato maschio su 3500 in tutto il mondo ed è la forma più comune e fatale di distrofia muscolare1,2. I pazienti affetti da DMD manifestano i primi sintomi clinici tra i 3 e i 4 anni di età e diventano dipendenti dalla sedia a rotelle tra i 7 e i 13 anni. Il periodo di deambulazione può essere prolungato in molti ragazzi affetti da DMD con l’inizio precoce del trattamento con steroidi. Lo stadio terminale della malattia inizia quando i pazienti necessitano di ventilazione assistita all'età di 20 anni e di solito muoiono nella terza o quarta decade a causa di insufficienza respiratoria o cardiaca3,4,5,6,7. La DMD deriva da mutazioni nel gene della distrofina che causano la sintesi di distrofina non funzionale o la sua totale assenza. La distrofina è un componente fondamentale del complesso glicoproteico associato alla distrofina (DGC) nel muscolo8. La DGC è una struttura che si estende sul sarcolemma e forma un collegamento meccanico tra il citoscheletro interno e la matrice extracellulare attraverso l'associazione della distrofina rispettivamente con i citoscheletri di actina e microtubuli e il legame del distroglicano con la laminina nella lamina basale9,10. Durante la contrazione muscolare, il DGC agisce come ammortizzatore molecolare e stabilizza la membrana plasmatica11,12. La perdita di distrofina è associata alla perdita del DGC e ne consegue il deterioramento e la degenerazione muscolare, impedendo così al DGC di esercitare le sue funzioni. Ciò rende le fibre muscolari più suscettibili al danno di membrana indotto dalla contrazione che porta alla morte cellulare13,14,15,16. Questo processo patologico è accompagnato da infiammazione e fibrosi che contribuiscono all'atrofia muscolare e alla perdita di funzione17,18,19,20,21.

Nonostante gli enormi sforzi di ricerca, non è ancora disponibile alcuna cura per i pazienti affetti da DMD. Strategie terapeutiche basate sui geni, come lo skipping dell'esone, la soppressione dei codoni di stop, il rilascio di mini-distrofina mediato dal virus adeno-associato (AAV) o l'editing genetico CRISPR/Cas9 sono attualmente oggetto di studio per il trattamento della DMD22,23. Parallelamente si stanno sviluppando anche trattamenti farmacologici24,25,26,27. Tali approcci agiscono su specifici percorsi di segnalazione ed eventi cellulari, compresi quelli che possono causare una sovraregolazione dell'utrofina A28,29,30. Ciononostante, i glucocorticoidi rappresentano ancora la terapia gold standard, agendo principalmente come farmaci antinfiammatori31. Con l’uso di steroidi e cure multidisciplinari, in particolare la ventilazione meccanica, l’aspettativa di vita dei pazienti affetti da DMD è stata notevolmente estesa e gli individui affetti possono ora raggiungere i 30-40 anni di età.

0.05). Together, these data indicate that intraperitoneal injection of TubA efficiently and specifically inhibits HDAC6 deacetylase activity in muscle./p> 0.05; Mann–Whitney U test. kDa, relative molecular weight in kiloDalton./p>

0.05; Mann–Whitney U test. kDa, relative molecular weight in kiloDalton./p> 0.05; Supplementary Figure 2b). Nevertheless, TubA efficiently prevented the formation of areas with high collagen content in mdx EDL muscle. Altogether, these data show that HDAC6 inhibition in dystrophic muscle reduces central nucleation, normalizes fiber size distribution, decreases the proportion of small fibers, and prevents fibrosis./p> 0.05 compared with mdx-veh mice; Fig. 1d). In healthy muscle, the microtubule network forms a grid lattice with longitudinal, transverse, and perinuclear microtubules78,79,80. Here, in WT-CTL mice, we observed that transverse and longitudinal microtubules are regularly spaced by ∼2 µm and ∼5 µm, respectively (see arrowheads Fig. 3a, and Supplementary Fig. 3c–e). In mdx muscles, immunofluorescence experiments show a disorganization of the microtubule network, with a loss of the grid-like organization (see arrows Fig. 3a). Interestingly, in mdx mice treated with TubA the microtubule lattice was restored (see the spacing between microtubules in the blue and yellow line scans and Supplementary Fig. 3c–e). We further analyzed the microtubule network with a software specifically developed to analyze microtubule directionality81 (TeDT program; Fig. 3b). TeDT program analysis revealed a significant decrease of transversely oriented microtubules (centered around 90°) in vehicle-treated mdx muscles compared to WT and to TubA-treated mdx mice (P < 0.05 compared with mdx-veh mice). These data show that TubA treatment improves the organization of the microtubule network in mdx muscles. In agreement with previous work57,82, this further demonstrates that microtubule acetylation via HDAC6 inhibition stabilizes microtubules and favors their transverse orientation./p> 0.05; Mann–Whitney U test. kDa, relative molecular weight in kiloDalton./p> 0.05. kDa, relative molecular weight in kiloDalton./p>

0.05; Fig. 5l). This increase in Smad3 acetylation was paralleled by a 55% ± 4% decrease of Smad3 phosphorylation on Ser432-425 (P < 0.05; Fig. 5m). In mdx mice, TubA treatment had a tendency to increase the total level of Smad2/3 compared to mdx-veh animal. However, this increase was not statistically significant (P = 0.0571; Fig. 5n). The effect of TubA on Smad4 and Smad7 levels was also evaluated, and no difference was observed with controls (Supplementary Fig. 5e–h)./p>