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Nature Communications volume 13, numero articolo: 4906 (2022) Citare questo articolo

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Gli approcci di etichettatura di prossimità su base enzimatica basati su esteri attivati o radicali fenossilici sono stati ampiamente utilizzati per mappare il proteoma subcellulare e gli interattori proteici nelle cellule viventi. Tuttavia, gli esteri attivati sono scarsamente reattivi, il che porta ad un ampio raggio di marcatura e i radicali fenossilici generati dal trattamento con perossido possono disturbare i percorsi sensibili al redox. Qui, riportiamo un metodo di etichettatura di prossimità dipendente dalla fotoattivazione (PDPL) progettato attaccando geneticamente la proteina fotosensibilizzante miniSOG a una proteina di interesse. Attivato dalla luce blu e sintonizzato dal tempo di irradiazione, viene generato ossigeno singoletto, consentendo successivamente l'etichettatura con sonda di anilina risolta spaziotemporalmente dei residui di istidina. Dimostriamo la sua alta fedeltà attraverso la mappatura di proteomi specifici degli organelli. Il confronto fianco a fianco di PDPL con TurboID rivela una copertura proteomica più specifica e profonda da parte di PDPL. Applichiamo inoltre PDPL al coattivatore trascrizionale BRD4 e alla ligasi E3 Parkin correlati alla malattia e scopriamo interattori precedentemente sconosciuti. Attraverso lo screening della sovraespressione, vengono identificati due substrati non segnalati Ssu72 e SNW1 per Parkin, i cui processi di degradazione sono mediati dalla via dell'ubiquitinazione-proteosoma.

La precisa caratterizzazione delle reti proteiche è alla base di molti processi cellulari fondamentali1. Pertanto, la mappatura spaziotemporale ad alta fedeltà delle interazioni proteiche fornirebbe una base molecolare per decifrare percorsi biologici, patologie patologiche, nonché il potenziale per perturbare queste interazioni a fini terapeutici2. A tal fine, sono altamente necessari metodi in grado di rilevare interazioni transitorie nelle cellule o nei tessuti viventi. La spettrometria di massa con purificazione di affinità (AP-MS) è stata storicamente utilizzata per abbattere i partner leganti di una proteina di interesse (POI). Con i progressi negli approcci di proteomica quantitativa, è stato creato il più grande database di reti proteiche Bioplex3.0 basato su AP-MS3. Sebbene l'AP-MS sia estremamente potente, le fasi di lisi cellulare e di diluizione nel flusso di lavoro distorcono le interazioni di legame deboli e transitorie e introducono artefatti post-lisi, come coppie spuriamente interagenti prive di compartimentazione prima della lisi4.

Nel tentativo di affrontare queste sfide, sono stati sviluppati amminoacidi non naturali (UAA) con gruppi reticolanti e piattaforme di etichettatura enzimatica di prossimità (PL) (ad esempio APEX e BioID)5. Sebbene i metodi UAA siano stati applicati con successo in molti scenari e forniscano informazioni sui leganti proteici diretti6, è ancora necessaria l'ottimizzazione dei siti di inserimento dell'UAA. Ancora più importante, si tratta di un metodo di etichettatura stechiometrico privo di turnover catalitico dell'evento di etichettatura. Al contrario, i metodi enzimatici PL come il metodo BioID fondono una biotina ligasi ingegnerizzata nel POI7, con successiva attivazione della biotina per generare l'intermedio biotinoil-AMP dell'estere reattivo. In quanto tale, l'enzima catalizza e rilascia una "nuvola" di biotina attivata, che marca i residui prossimali di lisina. Tuttavia, BioID richiede più di 12 ore per ottenere un segnale di etichettatura sufficiente, il che ne impedisce l'applicazione in modo temporaneamente risolto. Utilizzando l'evoluzione diretta basata sulla visualizzazione del lievito, TurboID è stato progettato da BioID con un'efficienza molto maggiore, ottenendo un'etichettatura efficace della biotina entro 10 minuti8, rendendo possibile lo studio di processi più dinamici. Poiché TurboID è altamente attivo e i livelli endogeni di biotina sono sufficienti per l'etichettatura di basso livello, l'etichettatura di fondo diventa una potenziale preoccupazione quando è necessaria un'etichettatura fortemente potenziata e regolata nel tempo attraverso l'aggiunta di biotina esogena. Inoltre, le specie estere attivate sono scarsamente reattive (t1/2 ~5 min), il che può portare ad un ampio raggio di marcatura, in particolare dopo la saturazione delle proteine vicine con biotina5. In un approccio diverso, una fusione genetica della perossidasi dell'acido ascorbico ingegnerizzato (cioè APEX) genera radicali biotina-fenolo dopo l'attivazione con H2O2 e raggiunge la marcatura delle proteine entro un minuto9,10. APEX è stato ampiamente utilizzato per identificare proteomi subcellulari, complessi proteici di membrana e complessi proteici di segnalazione citosolica11,12. Tuttavia, la necessità di elevate concentrazioni di perossido può influenzare le proteine o i percorsi sensibili al redox, perturbando i processi cellulari.

8-fold increase in signal for probe 3, while probe 2 used in the RNA-labeling method CAP-seq only displaying ~2.5-fold signal increase, likely due to different reactivity preferences between RNA and protein (Fig. 1b, c). Furthermore, the isomers of probe 3 and hydrazine probe (probe 5, 6, 7) were also tested, confirming probe 3 as the optimized one (Supplementary Fig. 1b, c). Likewise, in-gel fluorescence analysis determined other optimized experimental parameters: illumination wavelength (460 nm), chemical probe concentration (1 mM), and illumination time (20 min) (Supplementary Fig. 2a–c). Omission of any component or step in the PDPL protocol resulted in significant reversion of signal-to-background (Fig. 1d). Notably, protein labeling was greatly reduced in the presence of sodium azide or trolox, which are known to quench singlet oxygen28. The presence of D2O, known to stabilize singlet oxygen, enhanced the labeling signal. To investigate the contribution of other reactive oxygen species to labeling, mannitol and vitamin C, established hydroxyl radical and superoxide radical scavengers respectively18,29, were added but not found to reduce labeling. The addition of H2O2 rather than illumination failed to generate labeling (Supplementary Fig. 3a). Fluorescent imaging of singlet oxygen by Si-DMA probe confirmed the presence of singlet oxygen in the HEK293T-miniSOG line, but not the parental HEK293T line. In addition, mitoSOX Red was unable to detect superoxide generation after illumination (Fig. 1e and Supplementary Fig. 3b)30. These data strongly indicate singlet oxygen as the major ROS that gives rise to subsequent proteome labeling. The cytotoxicity of PDPL, including the blue light illumination and chemical probe treatment, was evaluated, and no significant cytotoxicity was observed (Supplementary Fig. 4a)./p>2-fold ion intensity difference). Relevant proteins that are significant in HEK293T-miniSOG but not in HEK293T are marked in green. e Specificity analysis for proteomic data sets derived from experiments in d. Total numbers of statistically significant proteins in each organelle (red and green dots) were labeled on top. Bars show organelle-localized proteins based on MitoCarta 3.0, GO analysis, and A. Ting et. al. dataset for mitochondrial, nucleus, and ER, respectively. These experiments were independently repeated at least twice with similar results. Source data are provided as a Source Data file./p>2-fold ion intensity) as well as singleton proteins that are only present in miniSOG-expressing lines (Fig. 3d red and green dots). Combining these data, we identified 1364, 461, and 911 statistically significant proteins for the nucleus, mitochondria, and ER outer membrane, respectively. To analyze the accuracy of organelle-localized PDPL, we used MitoCarta 3.0, Gene ontology (GO) analysis, and the A. Ting et al. dataset8 for mitochondria, nucleus, and ER to validate the organelle-specificity of detected proteins, which corresponded to 73.4, 78.5, and 73.0% accuracy (Fig. 3e). The specificity of PDPL validates that PDPL is an ideal tool for identifying organelle-specific proteomes. Notably, submitochondrial analysis of the identified mitochondrial proteins revealed that the captured proteome was mainly distributed in the matrix and inner membrane (226 and 106, respectively), accounting for 91.7% of the total identified mitochondrial proteins (362), which further confirmed the high-fidelity of PDPL (Supplementary Fig. 7a). Likewise, the subnuclear analysis revealed the captured proteome was predominantly distributed in the nucleus, nucleoplasm, and nucleolus (Supplementary Fig. 7b). Nucleus proteome profiling by nuclear localization signals (3xNLS) peptide revealed similar accuracy to H2B construct (Supplementary Fig. 7c–h). To define the labeling specificity of PDPL, nuclear Lamin A was selected as a more discretely localized POI bait7. PDPL identified 36 significantly enriched proteins, with 12 proteins (30.0%, including Lamin A) being well-characterized Lamin A interacting proteins annotated by the String database, representing a higher percentage than the BioID method (28 out of 122 proteins, 22.9%)7. Our method identified less proteins, likely due to the restricted labeling area, enabled by more reactive singlet oxygen. GO analysis reveals that the identified proteins are mainly located in the nucleoplasm (26), nuclear envelope (10), nuclear membrane (9), and nuclear pore (5). Combined, these nucleus-localized proteins account for 80% of the enriched proteins, further demonstrating the specificity of PDPL (Supplementary Fig. 8a–d)./p>2-fold ion intensity difference). Relevant proteins that are significant in HEK293T-miniSOG but not in HEK293T are marked in green. b Venn diagram showing overlapping proteins between N-terminal and C-terminal constructs. N-terminal tagging can aberrantly activate Parkin and lead to more identified proteins. c Venn diagram showing overlapping proteins between PDPL and AP-MS. Known interactors are listed, including four proteins out of 18 overlapped proteins, as well as 11 proteins out of 159 exclusively identified in PDPL. d Representative targets identified by LC-MS/MS were validated using Western blot. e Ssu72 and SNW1 were identified as unreported substrates of Parkin. Plasmids with these proteins labeled with FLAG were transfected into HEK293T and HEK293T-Parkin-miniSOG, followed by CCCP treatment across different time points. The degradation is more significant in the Parkin overexpressing line. f The Ssu72 and SNW1 degradation process was confirmed to be mediated by the ubiquitination-proteasome pathway by using the proteasome inhibitor MG132. These experiments were independently repeated at least twice with similar results. Source data are provided as a Source Data file./p>

7+ were rejected for MS/MS./p>

7+ were rejected for MS/MS./p>2 (unless otherwise stated) and p value <0.05. Protein interaction analysis was performed using GO analysis as well as the String database./p>