Approfondimenti strutturali e meccanicistici sul β fungino

Natura volume 616, pagine 190–198 (2023) Citare questo articolo

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La sintasi FKS integrata nella membrana è coinvolta nella biosintesi del β-1,3-glucano, il componente principale della parete cellulare fungina1,2. L'FKS è il bersaglio di farmaci antifungini ampiamente prescritti, tra cui l'echinocandina e l'ibrexafunger3,4. Sfortunatamente, il meccanismo d’azione dell’FKS rimane enigmatico e ciò ha ostacolato lo sviluppo di farmaci più efficaci mirati all’enzima. Qui presentiamo le strutture di microscopia crioelettronica di Saccharomyces cerevisiae FKS1 e il mutante resistente all'echinocandina FKS1 (S643P). Queste strutture rivelano il sito attivo dell'enzima all'interfaccia membrana-citoplasma e un percorso di traslocazione del glucano che attraversa il doppio strato della membrana. Nelle strutture FKS1 si osservano lipidi legati multipli e notevoli distorsioni della membrana, suggerendo interazioni attive FKS1-membrana. Le mutazioni resistenti all'echinocandina sono raggruppate in una regione vicino a TM5–6 e TM8 di FKS1. La struttura di FKS1(S643P) rivela disposizioni lipidiche alterate in questa regione, suggerendo un meccanismo di resistenza ai farmaci dell'enzima mutante. Le strutture, il meccanismo catalitico e le intuizioni molecolari sulle mutazioni resistenti ai farmaci di FKS1 rivelate in questo studio fanno avanzare la comprensione meccanicistica della biosintesi del β-1,3-glucano fungino e stabiliscono una base per lo sviluppo di nuovi farmaci antifungini prendendo di mira FKS.

Le infezioni fungine invasive causano oltre 1,5 milioni di morti ogni anno, rappresentando una seria minaccia per la salute pubblica5. Tali infezioni sono di notevole preoccupazione (ad esempio causando un’elevata mortalità) per le popolazioni immunocompromesse e per i pazienti con COVID-19 (rif. 5,6) (https://www.cdc.gov/fungal/covid-fungal.html ). Classi limitate di farmaci antifungini e ceppi emergenti resistenti ai farmaci, come la recente epidemia di Candida auris multiresistente, hanno causato gravi sfide nel trattamento dei pazienti infetti7,8. Pertanto, esiste un’urgente necessità di sviluppare nuovi agenti antifungini8.

Il β-1,3-glucano è un componente fondamentale della parete cellulare dei funghi2, ​​quindi mirare alla sua biosintesi rappresenta una strategia importante per lo sviluppo di farmaci antifungini ad ampio spettro3,9. Il β-1,3-glucano della parete cellulare fungina è sintetizzato dalla sintasi integrata nella membrana FKS10,11, che è regolata dalla GTPasi Rho1 (rif. 12,13). FKS trasferisce il glucosio dal glucosio UDP del donatore alla catena crescente del glucano tramite collegamenti β-1,3-glicosidici e trasloca il β-1,3-glucano polimerizzato nello spazio extracellulare (Fig. 1a). Gli ortologhi FKS sono stati identificati in tutti i funghi analizzati e sono essenziali per la vitalità di molti importanti patogeni fungini. In Candida glabrata e S. cerevisiae, la distruzione simultanea di FKS1 e FKS2 ha mostrato un fenotipo letale14,15; FKS1 di Candida albicans e Cryptococcus neoformans sono essenziali per la vitalità16,17; la muffa Aspergillus fumigatus con delezione di FKS1 soffre di gravi difetti di crescita e lisi cellulare18. Attualmente, sul mercato sono presenti due farmaci antifungini ben noti che prendono di mira l’FKS: l’echinocandina, il farmaco antifungino di prima linea ampiamente utilizzato nella pratica clinica19, e l’ibrexafungerp, un farmaco fungicida orale recentemente approvato4. Altri nuovi agenti mirati alla funzione FKS (ad esempio, rezafungin) stanno entrando in studi clinici in fase avanzata4. Sfortunatamente, le mutazioni FKS sono strettamente legate alla resistenza alle echinocandine e al fallimento terapeutico, una preoccupazione emergente nelle infezioni fungine invasive20,21. Numerose mutazioni resistenti all'echinocandina identificate clinicamente sono concentrate in tre regioni conservate di FKS20,22. Le mutazioni in un singolo allele FKS sono sufficienti a rendere i ceppi fungini resistenti all'echinocandina23.

a, modello della parete cellulare fungina. FKS1 utilizza UDP-Glc per sintetizzare il β-1,3-glucano. L'immagine nel pannello a è stata creata utilizzando BioRender (https://biorender.com). b, Analisi in vivo di FKS1 esaminando la crescita del ceppo WT e del ceppo FKS1-KO (KO) con o senza l'inibitore FKS2 FK506. I dati sono media ± sem; n = 3 esperimenti indipendenti. c, Attività in vitro di FKS1 purificato da CHAPS con diversi effettori: UDP-Glc, Rho1, GTPγS e farmaci antifungini (caspofungin (CFN) e micafungin (MCF)). L'attività è stata misurata monitorando l'UDP generato. I dati sono media ± sem; n = 3 esperimenti indipendenti. d, e, Digestione enzimatica del polimero insolubile in acqua sintetizzato da FKS1 (S643P) purificato dalla GDN. Sono state utilizzate endo-1,3-β-glucanasi ed endo-1,4-β-glucanasi specifiche. Questi esperimenti sono stati ripetuti tre volte con risultati simili. Viene mostrata un'immagine rappresentativa dei campioni di digestione del polimero (d) e idrolisi in d prelevati nei tempi indicati e soggetti ad analisi cromatografica su strato sottile (e). Glucosio (G1), laminaribiosio (G2), laminaritriosio (G3) e laminarihexaose (G6) sono stati utilizzati come standard (corsia M). f, analisi del legame glicosilico (metilazione) del polimero sintetizzato da FKS1 (S643P) purificato dalla GDN. Viene mostrato un profilo gascromatografico degli acetati di alditolo parzialmente metilati derivati ​​dai polimeri sintetizzati. Il picco dominante (delineato da una casella tratteggiata verde) rappresenta il collegamento 1,3-Glcp, confermato dalla spettrometria di massa (Dati estesi Fig. 2d). g, Schema dell'organizzazione del dominio di FKS1. h, mappa Cryo-EM di FKS1, vista parallela alla membrana. La mappa è segmentata in quattro parti colorate in g con densità simili ai lipidi in giallo chiaro. i, Due viste ortogonali della struttura FKS1 in visualizzazione cartoon. Quattro parti di FKS1 sono colorate come in g. j, Vista intracellulare della regione citoplasmatica con il dominio TM nascosto. Il foglio β centrale del dominio FKS1 GT è composto da β3–β11 come etichettato. Le linee tratteggiate indicano regioni disordinate.